01
背景介绍
水包油（O/W）乳液在日常生活中普遍存在，具有广泛的用途。牛奶、奶油、冰淇淋、调味品、蛋黄酱、饮料、汤、蘸酱和酱汁是最常见的例子。从蛋白质等可食用生物聚合物中提取的胶体，无论是作为聚合物还是作为胶体颗粒，在乳液稳定性方面都存在挑战。这是因为当蛋白质在界面上扩散时，其构象会不断变化，随后的双相相互作用通常会导致不可逆的界面解吸。
本文设计了双蛋白纳米结构（DPN），其中刚性组分（核桃蛋白，WPs）表现为纳米颗粒，另一种纤维组分（大米蛋白，RPs）是将纳米颗粒连接到3D网络的桥梁。由于WPs和RPs都具有疏水性，并且易于自聚集形成团聚体。单个蛋白的乳化性能较差，为了创造合适的溶液环境，使疏水性蛋白得以分散和稳定，通常使用高浓度的变性剂，例如尿素。即使去除变性剂后，也无法在食品中应用。但是，WPs和RPs的混合物中和形成碱性溶液（pH12.0），使WPs与RPs同时复性，并通过疏水力形成水分散性DPN。
02
研究方法
本研究使用不同体积的核桃油与DPN溶液混合，制备高内相乳液（HIPEs）。并对蛋白结构及其高内相乳液进行表征。最后通过加热、长期储存和反复冻融处理来验证HIPEs的稳定性。
03
结果与分析
RPs和WPs都是疏水蛋白质，具有强烈的聚集倾向，由高比例的疏水氨基酸残基形成。透射电子显微镜（TEM）显示，RPs通过缔合形成了良好的网络（图1a），而相同情况下WPs网络结构较差（图1b）。形态上的差异可能归因于不同的氨基酸组成及其组合形成不同的分子结构。通过在pH12下以WPs/RPs质量比0.5溶解两种蛋白质并中和酸度，形成了离解颗粒（图1c），表明形成了不同于单个蛋白质的复合结构。TEM显示，复合物具有未分解的结构，覆盖相对凝固的核心，这表明蛋白质折叠不完全（图1c）。进一步将WPs/RPs质量比增加到1.0，得到了更清晰、更小的纳米颗粒，其直径为几十纳米（图1d；图1h），这些纳米颗粒通过空间纤维交联（图1d的放大）。原子力显微镜（AFM）显示，当样品制备浓度高于TEM（20μg/mL与10μg/mL）时，这些交联颗粒形成三维（3D）网络（图1e）。ANS标记的RPs呈现出强烈的pH依赖性，其强度随着pH值从12.0降低到7.0而增加（图1g），表明蛋白的折叠。相比之下，ANS标记的WPs显示出可忽略的pH依赖性，表明具有相当大的结构稳定性（图1g）。结果表明，RPs的折叠受到抑制，而WPs在pH处理下相当稳定。
图1蛋白的微观结构和物理化学性质（a）RP、（b）WPs和WPs/RP质量比为（c）0.5和（d）1.0的DPN的透射电镜图像（e）WPs/RPs质量比为1.0的DPN的AFM图像（f）DPN网络的示意图（g）ANS标记蛋白的pH依赖性荧光强度
如图2所示，用3%（w/v）DPNs在Φ80%下制备的HIPEs在50~95℃下加热30分钟,之后冷却至室温（25℃），粒度分布显示不同制剂之间的分布曲线相似。在处理过的样品中，d4,3随温度的升高而升高，在95℃加热30min时，未经处理的样品从15μm增加25μm。然而，如光学显微镜图片所示，所有加热的HIPEs呈现出不变的形态，并且它们都通过了反转测试，这表明HIPE具有良好的热稳定性，DPN与O/W界面的分离不明显。
图2蛋白浓度为3%（w/v）和Φ80%时制备的HIPEs油滴的温度依赖性d4,3。最上面的插图是与温度相关的尺寸分布；底部插图是HIPS反转测试（左）和光学显微镜（右）的相关照片
如图3a所示，未添加NaCl的HIPEs冻融稳定性较差，其特征是会有大量破乳和油析。大冰晶的撞击使O/W界面变形，当与冻融过程中溶质的浓缩稀释结合时，会导致解吸。添加25mMNaCl的HIPEs具有轻微的聚结行为，并在第一次冻融循环后通过倒置试验（图3a）。在随后的冻融循环中，这些HIPEs发生破乳，失去了胶凝特性，出现明显的纹理断裂。与之形成鲜明对比的是，在水相DPNs中添加50mMNaCl的HIPEs表现出良好的冻融稳定性，与未经冻融处理的DPN表现出相似的外观和反转稳定性。通过差示扫描热量仪（DSC）测定DPN分散体的凝固点。图3b显示，随着NaCl添加量的增加，溶液的冰点降低，降至-10.12℃增加mm。所有样品的冰点都远高于冻融循环中使用的处理温度（–20℃）。因此，DPN中添加适当的NaCl可以在O/W界面形成稳定的结构，对冰晶的冲击和浓度稀释引起的解吸具有明显的抵抗力。
图3蛋白质浓度为3%（w/v）和Φ80%时制备的HIPEs冻融稳定性
04
结论
在此研究中，WPs的纳米颗粒与未折叠的原纤维RPs结合，形成具有三维网络特征的DPN。由于WPs和RPs都是疏水性的，不溶于水，因此具有高胶体稳定性的DPN被用于稳定O/W乳液，与疏水性和亲水性以及内聚网络能力相关。在适当的蛋白浓度下，DPNs制备的HIPEs在95℃时表现出优异的热稳定性。此外，通过NaCl进一步加强蛋白-蛋白结合以稳定DPN网络，HIPEs表现出更强的凝胶特性，能够承受反复冻融处理。此研究结果有助于深入了解界面网络结构，对于热力学稳定的HIPE至关重要。
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